質(zhì)量的eoDNA更是探究結(jié)果準(zhǔn)確性的保證。目前,對于eoDNA的獲取,使用的方法主要有:苯酚–氯仿抽提法、微柱吸附法、磁珠吸附法。Fleischhacker等[55]比較了三種試劑盒(QIAampDNABloodMidiKitfromQiagen,NucleoSpinKitfromMacherey-Nagel,MagNAPureisolationsystemfromRocheDiagnostics)獲取eoDNA的效率,認(rèn)為DNA富集方法在定量檢測中起到很重要的作用。Yuan等[80]用改良苯酚–氯仿法富集eoDNA,高效地檢測到eoDNA中的EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor),且其檢出率要高于微柱吸附法試劑盒。Chen等[81]研究表明,傳統(tǒng)苯酚–氯仿法雖收集的DNA純度不是很高,但是DNA的含量相對高純度PCR模板制備試劑盒和單細(xì)胞PCR要高得多,是相對最有效率的提純方法。
嚴(yán)子禾等[82]比較了傳統(tǒng)苯酚–氯仿法、微柱吸附法試劑盒和磁珠吸附法試劑盒對血漿游離結(jié)核分枝桿菌DNA和質(zhì)粒DNA的提取效率,得出磁珠吸附法對血漿游離DNA的提取效率最高,尤其適合于小片段DNA的提取。宋小燕等[83]通過對國產(chǎn)試劑盒提取血漿DNA的方法進(jìn)行改良,提取的血漿DNA的質(zhì)量不僅能達(dá)到相關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求,而且操作簡單、耗時短、成本低。Yin等[84]將鹽析與苯酚–氯仿法相結(jié)合并進(jìn)行改進(jìn)提取血漿DNA,得到的總DNA是微柱吸附法試劑盒提取方法的兩倍。通過此法得到總DNA后,又根據(jù)胎兒DNA分子片段長度小于孕婦自身DNA的原理,利用純化PCR產(chǎn)物的過濾膜裝置過濾提取的血漿DNA,得到的胎兒DNA是微柱吸附法試劑盒提取方法的8倍。
從妊娠婦女外周血中得到胎兒DNA主要有兩種途徑,一種是從妊娠婦女外周血中富集純化胎兒細(xì)胞,另一種是從孕婦血中直接獲取cffDNA。目前,主要的提取方法是提取出母體血漿總DNA,然后再用特異的引物擴(kuò)增來判斷胎兒特異性DNA序列,也有依據(jù)分子大小分離得到cffDNA,還有用肽核酸來富集得到cffDNA序列
綜上所述,傳統(tǒng)苯酚–氯仿抽提法,雖操作復(fù)雜、特異性差,但提純效率較好,改良后是一種高效、廉價的富集方法;微柱吸附法,操作簡便、DNA純度相對較高、重復(fù)性好,但成本相對較高,而且對小片段DNA丟失較嚴(yán)重;磁珠法采用磁珠吸附,磁場分離的原理,操作簡便、快速、DNA純度高,特別適合小片段eoDNA的富集。
eoDNA被認(rèn)為是檢測腫瘤組織的一種替代標(biāo)記,然而由于eoDNA含量低、片段小,在提取過程中極易丟失,特別是腫瘤特異DNA片段,因多出現(xiàn)在小片段上而在提取過程中更易丟失,一些腫瘤的特異基因可以在組織中檢測到卻不能在eoDNA中檢測到[80,85]。此外,在腫瘤患者體內(nèi),腫瘤的惡化使腫瘤微環(huán)境中正常細(xì)胞產(chǎn)生大量eoDNA,而造成腫瘤相關(guān)DNA相對含量下降,檢測背景升高。還有一些檢測手段要求樣品中DNA濃度必須達(dá)到一定的濃度,如甲基化特異性多連接依賴性探針擴(kuò)增(methylation-specificmultiplexligation-dependentprobeamplification,MS-MLPA)要求檢測DNA必須達(dá)到50ng/L[86]。而對于臨床檢測具有實(shí)用性的廉價分光光度法,現(xiàn)在所獲取的eoDNA的濃度還遠(yuǎn)不能達(dá)到其檢測線
